שיטות לזיהוי זרחון חלבון וגליקוזילציה

Aug 02, 2024 השאר הודעה

השיטות העיקריות לזיהוי זרחן הן כדלקמן: א. ניתוח זרחן במבחנה: ניתן להשתמש בתגובות קינאז רדיומטריות באמצעות 32P-gamma-ATP כדי לזהות מצב זרחון במבחנה; שיטה זו היא כמותית למחצה, אך יכולה לקבוע את המשקל המולקולרי של חלבונים מפוספסים. ב. תיוג דופק רדיואקטיבי: כדי לזהות זרחון in vivo, ניתן להשתמש בתיוג דופק רדיואקטיבי; תאים גדלים בנוכחות 32P-orthophosphate, ולאחר מכן חלבון מסוים הוא immunoprecipitated עם נוגדן ספציפי. הרדיואיזוטופ המתקבל על ידי משקעים מנותח על ידי אלקטרופורזה SDS-PAGE ומכומת על ידי חשיפה לסרט רנטגן. שיטה זו יכולה לזהות זרחון בתנאים פיזיולוגיים שונים. ג. נוגדנים ספציפיים לזרחון: ישנן שתי קטגוריות של נוגדנים ספציפיים לזרחון. הקטגוריה הראשונה היא נוגדן טירוזין/סרין/תרונין פוספורילציה אוניברסלי שייקשר לכל מולקולת טירוזין מזרחנת, סרין פוספוריל ותריונין פוספוריל, ללא קשר לשאריות חומצות אמינו סמוכות; הקטגוריה השנייה של נוגדנים היא נוגדן אפיטופ חומצות אמינו ספציפיות לזרחון. כמובן, ניתן לשלב את השיטות הנ"ל עם מצב רכישת נתונים או לאחר ספקטרומטריית מסה כדי לזהות אתרי זרחון (משוערים), להשתמש בנוגדנים אוניברסליים לאתרי זרחון כדי לקבוע אם חלבון המטרה מזורחן בסוג מסוים של אתר באמצעות משקעים אימוניים (IP) .

 

ניתן לבצע ניתוח גליקוזילציה על ידי עיכול אנזימטי (כגון עיכול טריפסין) של החלבון המיועד לניתוח, ולאחר מכן ניתוח של גליקופפטידים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS) או כרומטוגרפיה הידרופלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HILIC-MS/ MS) כדי לזהות את כל החלבונים עם מולקולות גליקן ספציפיות, או אתרי הקישור לגליקנים בחלבון היעד. בנוסף, עבור כמה גליקופפטידים, ניתוח ספקטרומטריית מסה (MS) של חלבונים שלמים יכול לספק נתונים על זיהוי מיני חלבונים ומצב הגליקוזילציה שלהם, אך ברזולוציה נמוכה יותר.

 

לסיכום, למרות שהשיטות לזיהוי זרחון וגליקוזילציה של חלבונים שונות, ניתן לנתח את שתיהן באמצעות ספקטרומטריית מסה, לרבות זיהוי של חלבונים מפוספורילציה/גלוקוזילציה, אתרי שינוי זרחון/גליקוזילציה ורמות שינוי. ספקטרומטריית מסה הפכה גם לאחת מטכנולוגיות המחקר הפופולריות ביותר של שינוי תרגום, בשל הרזולוציה, הדיוק והרגישות המעולים שלה.

שלח החקירה

whatsapp

טלפון

דוא

חקירה